药学分子生物学重点小抄

3、DNA双螺旋结构模型的提出（1953，Watson和Crick） 4、中心法则：

1、核酸的种类：DNA和RNA 2、DNA的结构与功能：

（1）一级结构的定义：指4种脱氧核糖核苷酸的连接及其排列顺序

（2）二级结构的定义：指两条脱氧核苷酸链以反向平行的形式，围绕同一个中心轴盘绕所形成的双螺旋结构。分类：右手螺旋：A-DNA，B-DNA， C-DNA， D-DNA 左手螺旋：Z-DNA

（3）DNA的三级结构定义：指在DNA双螺旋结构基础上，进一步扭曲所形成的特定空间结构。 主要形式：超螺旋结构。

（4）拓扑异构酶定义：细胞内存在的一类能催化DNA拓扑异构体相互转化的酶

4、核酸的分子杂交：

（1）概念：杂交分子：已经复性的DNA分子，如果两条链来源不同，则称为杂交分子。

核酸的杂交：序列互补的单链核酸根据碱基配对原则，借助氢键相连而形成双链杂交分子的过程。

探针：是指能够与靶分子核酸按碱基互补原则特异性相互作用的一段已知序列的寡核苷酸或核酸。

（2）杂交的种类： Southern、 Northern、Western、原位杂交 5、反义核酸：根据碱基互补原理，用人工合成或生命有机体合成的特定互补的DNA或RNA片段。功能：抑制或封闭目的基因的表达。 反义技术：根据碱基互补原理，用人工合成或生物体合成的特定互补的DNA或RNA片段抑制或封闭基因表达的技术。 1、染色体的化学成分及组成

（1）染色体的化学成分：染色体主要有DNA、蛋白质以及少量的RNA和酶组成。其中，蛋白质又分为组蛋白（H1、H2A、H2B、H3、H4）和非组蛋白。DNA和组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）构成核小体。 （2）根据DNA复性动力学，可将真核生物DNA序列分为哪几种四种类型？（非重复序列、轻度重复序列、中度重复序列、高度重复序列）

（3）组蛋白的种类：H1组蛋白、核小体组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）。 2、基因

（1）基因的分子生物学定义：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。

（2）基因功能（中心法则）： （3）真核生物基因特征

不连续基因/断裂基因：指在DNA分子上的编码序列是不连续的,被不编码的序列所隔开的基因。 外显子：在真核生物断裂基因及其初级产物上出现，并表达成熟RNA的核酸序列，叫外显子；

内含子：在真核生物基因中，不为蛋白质编码的、在mRNA加工过程中消失的核酸序列，称内含子。

RNA剪接：真核基因转录之后，除去内含子、连接外显子的过程。

基因家族：真核细胞的基因组中有许多来源相同、结构相似、功能相关的基因，这样的一组基因称为基因家族。

基因簇：在基因家族中，一类基因串联排列在一起形成基因簇。 假基因：在基因家族中,不能产生有功能基因产物的基因称为假基因。用ψ表示。 ３、基因组

（1）基因组定义：基因组是细胞中一套完整单体的遗传物质的总和。

（2）原核生物基因组的结构特点：基因组较小、几乎无蛋白质同核酸结合、有操纵子结构、有单拷贝和多拷贝两种形式、有重叠基因、多顺反子。

真核生物基因组的结构特点：基因组较大、有重复序列、有单拷贝和多拷贝两种形式、基因不连续、基因家族化、DNA片段可以重排、单顺反子、和蛋白质结合，形成染色体，而且是多条。

1、转座子的定义：存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。

作用特点：①两端有反向重复序列；②转座后靶位点重复是正向重复；③编码与转座有关的蛋白；④可以在基因组中移动

2、质粒：定义：多数细菌和某些真核生物细胞的染色体外的双链环状DNA分子。

构型：共价闭合环型DNA（cccDNA）、开环DNA（ocDNA）、线性DNA（ss-DNA）

复制类型：严谨型复制【拷贝数少（1 至 数个 拷贝）】 松弛型复制【拷贝数多（10 个拷贝以上）】 1、DNA复制：

（1）DNA复制的一般特征：

半保留复制：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，故称半保留复制。 双向复制

半不连续复制：DNA复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的，故称半不连续复制 需要RNA引物

（2）参与DNA复制的酶：

DNA 拓扑异构酶：拓扑异构酶І（转录）；拓扑异构酶Π：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用是将负超螺旋引入DNA分子。同复制有关。

DNA 解旋酶 /解链酶：通过水解ATP获得能量来解开双链DNA

单链DNA结合蛋白：稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。 引物合成酶（引发酶）：此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。

DNA聚合酶:：以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物、反应需要有模板的指导、反应需要有3-OH存在、DNA链的合成方向为5   3  DNA连接酶：若双链DNA中一条链有切口，一端是3’-OH，另一端是5‘-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来

（3）原核生物的DNA复制过程：起始、延伸、终止。

（4）真核生物DNA复制的特点：①每条染色体上有多个复制起点，多复制子；②染色体在全部复制完之前,各个起始点不再重新开始

DNA复制；而在快速生长的原核生物中，复制起点可以连续开始新的复制(多复制叉)。③有多种DNA聚合酶。

（5）线粒体DNA复制的方式：D环复制、单向复制。 ２、基因突变

突变概念：突变是指DNA碱基序列发生可遗传的改变

类型：碱基置换突变【点突变（转换和颠换、单点突变和多点突变）、碱基插入、碱基缺失】、移码突变【插入、缺失一个或两个碱基引起阅读框架的改变】、【同义突变、错义突变、无义突变】、【非条件性突变、条件性突变】、【正向突变、回复突变】、【启动子上升突变、启动子下降突变、组成型突变】

原因：㈠引起自发突变的因素主要有DNA复制中的错误、碱基本身存在互变异构体、DNA自发的化学改变（脱嘌呤作用、脱氨基作用）以及氧化作用损伤碱基；

㈡引起诱发突变的因素主要有放射线（紫外线、X-射线、γ射线、宇宙射线）和化学诱变剂（碱基类似物、氨基嘌呤、碱基修饰剂、DNA插入剂）

３、ＤＮＡ的修复系统：复制修复（尿嘧啶糖基酶系统、错配修复）、损伤修复（光复活、甲基转移酶、切除修复）、复制后修复（重组修复、SOS修复） 第五章：

1、转录：生物体以DNA为模板合成RNA的过程。

转录的不对称性：在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。

编码链与模板链：与mRNA序列相同的那条DNA链称为编码链；将另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链称为模板链。 3、RNA聚合酶：

原核生物RNA聚合酶组成：全酶=核心酶+ σ因子

真核生物RNA聚合酶的种类：RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ、RNA聚合酶Ⅲ

4、启动子：指能被RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段具有高度保守性的DNA序列。

原核生物启动子结构：转录起始点、-10序列（-TATAAT,RNA聚合酶结合位点）、-35序列（-TTGACA,RNA聚合酶识别位点）、作用部位间隔区（-35序列和-10序列之间的间隔区为17bp时转录效率最高）、CAP结合位点。

真核生物启动子Ⅱ的结构；起始子、TATA框（决定转录的方向和使转录精确地起始）、CAAT框（与GC框构成上游启动子元件，功能为控制转录起始频率）、增强子。

5增强子：指能使和它连琐的基因转录频率明显增加的DNA序列。 性质：①增强效应十分明显②增强效应与其位置和取向无关③大多为重复序列④增强效应有严密的组织和细胞特异性⑤没有基因专一性⑥许多增强子还受外部信号的。 6、终止子：提供终止信号的序列

种类：强终止子－ 不依赖ρ因子终止子；弱终止子 －ρ因子依赖性终止子

结构：强终止子—反向重复序列，富含G-C；下游存在固定序列，编码连富含T；转录的RNA形成茎环结构，3’端富含U。若终止子—回文序列中G-C碱基对较少，回文序列下游序列无固定特征。 7、原核生物转录的基本过程：起始、延长、终止（依赖因子的终止、不依赖因子的终止）

8、真核生物mRNA的前体加工过程：5’端加帽、3’端加尾、核苷甲基化、mRNA的剪接。

9、RNA剪接：切除内含子连接外显子，产生成熟的RNA分子的过程。 RNA编辑：指转录后的RNA在编码区发生碱基的加入、丢失或转换等现象。

1、定义：翻译：指将mRNA链上的核甘酸从一个特定的起始位点开始，按每三个核甘酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。

遗传密码：mRNA链上每三个核甘酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这三个核甘酸就称为遗传密码。

开放阅读框架：从AUG开始到终止密码子处的正确可读序列。 2、遗传密码的性质：简并性（减少了变异对生物的影响）、摆动性（转运氨基酸的tRNA上的反密码子需要通过碱基互补与mRNA上的遗传密码子反向配对结合，在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动”，这种现象称为密码子的摆动性）、通用性与特殊性、连续性、偏爱性。 4、核糖体的组成：大亚基、小亚基。

功能位点：肽位：结合或接受肽酰基-tRNA的部位；受位/氨基酰位：结合或接受AA-tRNA的部位

5、tRNA的结构：二级结构：三叶草形；三级结构： 倒“L”形。 功能：解读mRNA的遗传信息；运输的工具，运载氨基酸。

7、蛋白质合成后的转运方式：一是信号肽引导的经内质网膜运送途径，另一种是导肽引导的通过线粒体、叶绿体、过氧化物体、乙醛酸体膜的运送途径。

信号肽：常指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移的N-末端氨基酸序列（有时不一定在N端）。 1、基本概念： 基因表达：指基因通过转录和翻译而产生其蛋白质产物,或转录后直接产生其RNA产物的过程。

基因表达：对基因表达这个过程的调节就称为基因表达。 顺式作用元件：指可影响自身基因表达活性的DNA序列。

反式作用因子：一个基因表达的产物如果对另一个基因的表达具有作用，则被称为反式作用因子。

操纵子：是原核生物基因转录的主要形式，它是原核生物细胞DNA上的一段区域，由若干功能相关的结构基因和控制这些基因表达的元件组成的一个完整的连续的功能单位。

2、原核生物基因表达的四种类型：负控诱导、负控阻遏、正控诱导、正控阻遏。 3、乳糖操纵子：由启动基因P、操纵基因O以及3个结构基因LacZ、LacY、LacA组成。

机制：乳糖操纵子负机制：当缺乏乳糖时，阻遏蛋白以活性状态结合在LacO上，影响了RNA聚合酶与LacP的结合，并阻碍RNA聚合酶通过LacO，这样结构基因就无法转录；当乳糖存在时，异乳糖与阻遏蛋白结合，导致阻遏蛋白构象改变而脱离LacO，RNA聚合酶与LacP结合转录形成mRNA。

乳糖操纵子正机制：正的调节蛋白是分解代谢基因激活蛋白【CAP】，又称cAMP受体蛋白。当CAP与cAMP结合后，其构象发生变化，对DNA亲和力增强。由于CAP-cAMP与启动子的结合是激活转录的必要条件，当CAP-cAMP结合到LacPDNA后，可直接和RNA聚合酶相互作用，并以某种方式改变DNA结构，从而激活转录。 乳糖操纵子同时地受到正、负两个系统，结构基因要转录需要：CAP-cAMP结合到LacP上，阻遏蛋白脱离LacO。

【注】 1通常情况（葡萄糖供应正常）下，阻遏蛋白与操纵基因结合，结构基因不转录。 2、乳糖操纵子的表达必须满足两个条件:⑪培养基中缺少葡萄糖,细胞内cAMP浓度高;⑫必须有诱导物

4、色氨酸操纵子：由调节基因R、启动基因P、操纵基因O、前导区L、衰减子a以及5个结构基因LacE、LacD、LacC、LacB、LacA组成。

色氨酸操纵子的负控阻遏系统: 培养基中缺乏色氨酸时，阻遏蛋白没有活性，不能与操纵序列结合,此时，RNA聚合酶结合于启动子，操纵子表达； 培养基中色氨酸浓度高时，色氨酸与阻遏蛋白结合使之活化，能够与操纵序列特异性结合，导致RNA聚合酶无法与启动子结合，从而关闭操纵子的表达。

衰减作用：培养基中色氨酸的浓度很低时，前导区转录产物2-3区段配对，不形成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行；而当培养基中色氨酸浓度高时，前导区转录产物3-4区段配对形成发夹终止子结构，转录停止。

【注】 负控阻遏：转录起始的；衰减作用：转录终止的。

5、真核生物DNA水平上的方式：基因丢失、基因扩增、基因重排、DNA的甲基化和去甲基化。

6、反式作用因子的几种DNA结合结构域：螺旋-转角-螺旋、锌指结构、亮氨酸拉链、螺旋-环-螺旋 第八章：

1、基因工程的概念：按照人们的愿望，有意识地将一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。

基本步骤：⑪目的基因的获得⑫目的基因与载体的连接⑬重组DNA分子导入受体细胞⑭筛选出含重组DNA基因分子的受体细胞克隆⑮对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物

2、基因工程载体定义：携带外源DNA进入宿主细胞的工具 载体应具备的基本条件:具有适当的性内切酶切割位点、能够携带外源DNA片段进入受体细胞、具备复制原点，能够在宿主细胞中自主复制、具有合适的筛选标记、必须是安全的

4、质粒定义：于细菌染色体之外，能自主复制的共价闭合环状双链DNA。

DNA分子的构型：共价闭合环型DNA（cccDNA），SC构型、开环DNA（ocDNA），OC构型、线性DNA（ss-CDNA），LC构型

复制类型：严谨型复制【拷贝数少（1 至 数个 拷贝）】、松弛型复制【拷贝数多（10 个拷贝以上）】

5、目的基因制备和常用分离方法：化学合成(已知基因）、利用PCR扩增目的基因(已知基因）、构建基因组文库分离法(未知基因）、cDNA基因文库的构建及目的基因分离(未知基因）。

6、基因组文库：某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为这种生物的基因组文库。 cDNA基因文库：某种生物基因组转录的部分或全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌群体中，这样的群体称为cDNA基因文库。

7、构建cDNA文库的步骤：⑪细胞总ＲＮＡ的制备及mRNA的分离；⑫cDNA第一条链的合成；⑬双链cDNA的合成；⑭将合成的双链cDNA重组到质粒载体或噬菌体载体上，导入大肠杆菌宿主细胞增殖

8、PCR基本原理和步骤：变性：双链DNA解链成为单链DNA；退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合；延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链。

10、重组体的鉴定和分析(双脱氧终止法测序原理）：①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板,合成准确的DNA互补链;②该酶能够用2’,3’双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3’-末端，从而终止其延伸反应;③在DNA测序的4个特定反应体系中，分别加入模板DNA、引物、DNA聚合酶、dNTP和一种ddNTP，使DNA链的合成随机终止于某一特定ddNTP 。最后通过经凝胶电泳和放射自显影读出待测DNA片段的核苷酸序列。

11、真核基因在原核细胞中表达的特点：①原核细胞RNA聚合酶不能识别真核基因启动子；②真核DNA转录的mRNA缺乏SD序列；③真核基因含有内含子；④原核细胞缺乏真核细胞特有的蛋白质修饰系统；⑤真核蛋白质有时会被原核蛋白酶降解；⑥原核细胞不能切除真核前体蛋白的信号肽序列。

12、基因工程的应用：基因工程药物、转基因植物、转基因动物、基因治疗、基因芯片

1、基因：能够表达和产生蛋白质和RNA的DNA序列，是决定遗传性状的功能单位。

2、基因组：细胞或生物体的一套完整单倍体的遗传物质的总和。 3. 端粒：以线性染色体形式存在的真核基因组DNA末端都有一种特殊的结构叫端粒。该结构是一段DNA序列和蛋白质形成的一种复合体，仅在真核细胞染色体末端存在。

4、操纵子：是指数个功能上相关的结构基因串联在一起，构成信息区，连同其上游的区（包括启动子和操纵基因）以及下游的转录终止信号所构成的基因表达单位，所转录的RNA为多顺反子。 5.顺式作用元件：是指那些与结构基因表达相关、能够被基因蛋白特异性识别和结合的特异DNA序列。包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等。

6.反式作用因子：是指真核细胞内含有的大量可以通过直接或间接结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子。 7、启动子：是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。

8、增强子：位于真核基因中远离转录起始点，能明显增强启动子转录效率的特殊DNA序列。它可位于被增强的转录基因的上游或下游，也可相距靶基因较远。

9 基因表达：是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质，进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程。

12、分子克隆：在体外对DNA分子按照即定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入合适宿主，使其在宿主中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。

15、基因工程：有目的的通过分子克隆技术，人为的操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程。

16、载体：能在连接酶的作用下和外源DNA片段连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。

17、转化：指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌的过

程。

18、感染：以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。

19 转导：指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA的过程。 20、转染：指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。 21、DNA变性：在物理或化学因素的作用下，导致两条DNA链之间的氢键断裂，而核酸分子中的所有共价键则不受影响。

22、DNA复性：当促使变性的因素解除后，两条DNA链又可以通过碱基互补配对结合形成DNA双螺旋结构。

23、退火：指将温度降至引物的TM值左右或以下，引物与DNA摸板互补区域结合形成杂交链。

25、原位PCR：以组织固定处理细胞内的DNA或RNA作为靶序列，进行PCR反应的过程。

26、定量PCR：基因表达涉及的转录水平的研究常需要对mRNA进行定量测定，对此采用的PCR技术就叫定量PCR。

27、基因打靶：是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。

28、DNA芯片：DNA芯片技术是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。

29 错义突变：DNA分子中碱基对的取代，使得mRNA的某一密码子发生变化，由它所编码的氨基酸就变成另一种的氨基酸，使得多肽链中的氨基酸顺序也相应的发生改变的突变。

30、无义突变：由于碱基对的取代，使原来可以翻译某种氨基酸的密码子变成了终止密码子的突变。

31.同义突变：碱基对的取代并不都是引起错义突变和翻译终止，有时虽然有碱基被取代，但在蛋白质水平上没有引起变化，氨基酸没有被取代，这是因为突变后的密码子和原来的密码子代表同一个氨基酸的突变。

32、移码突变：在编码序列中，单个碱基、数个碱基的缺失或插入以及片段的缺失或插入等均可以使突变位点之后的三联体密码阅读框发生改变，不能编码原来的蛋白质的突变。

33、癌基因：是细胞内控制细胞生长的基因，具有潜在的诱导细胞恶性转化的特性。当癌基因结构或表达发生异常时，其产物可使细胞无增殖，导致肿瘤的发生。包括病毒癌基因和细胞癌基因。 34、细胞癌基因：存在于正常的细胞基因组中，与病毒癌基因有同源序列，具有促进正常细胞生长、增殖、分化和发育等生理功能。在正常细胞内未激活的细胞癌基因叫原癌基因，当其受到某些条件激活时，结构和表达发生异常，能使细胞发生恶性转化。

35、病毒癌基因：存在于病毒（大多是逆转录病毒）基因组中能使靶细胞发生恶性转化的基因。它不编码病毒结构成分，对病毒无复制作用，但是当受到外界的条件激活时可产生诱导肿瘤发生的作用。 36、基因诊断：以DNA或RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、结构缺陷或表达异常，对人体的状态和疾病作出诊断的方法和过程。 37、RFLP：即性片段长度多态性，个体之间DNA的核苷酸序列存在差异，称为DNA多态性。若因此而改变了性内切酶的酶切位点则可导致相应的性片段的长度和数量发生变化，称为RFLP。 38、基因治疗：一般是指将限定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态为目的治疗方法。

39、反义RNA：碱基序列正好与有意义的mRNA互补的RNA称为反义RNA。可以作为一种特定基因表达的手段。 40.核酶：是一种可以催化RNA切割和RNA剪接反应的由RNA组成的酶，可以作为基因表达和病毒复制的抑制剂。

41、三链DNA：当某一DNA或RNA寡核苷酸与DNA高嘌呤区可结合形成三链，能特异地结合在DNA的大沟中，并与富含嘌呤链上的碱基形成氢键。

42、SSCP：单链构象多态性检测是一种基于DNA构象差别来检测点突变的方法。相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。

43、管家基因：在生物体生命的全过程都是必须的，且在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达的基因。

44、细胞全能性：指同一种生物的所有细胞都含有相同的DNA，即基因的数目和种类是一样的，但在不同阶段，同一个体的不同组织和器官中基因表达的种类和数目是不同的。

45. SD序列：转录出的mRNA要进入核糖体上进行翻译，需要一段富含嘌呤的核苷酸序列与大肠杆菌16S rRNA3，末端富含嘧啶的序列互补，是核糖体的识别位点。

46.反义核酸技术：是通过合成一种短链且与DNA或RNA互补的，以DNA或RNA为目标抑制翻译的反义分子，干扰目的基因的转录、剪接、转运、翻译等过程的技术。

47、核酸探针：探针是指能与某种大分子发生特异性相互作用，并在相互作用之后可以检测出来的生物大分子。核酸探针是指能识别特异碱基顺序的带有标记的一段DNA或RNA分子。

49、CAP：是大肠杆菌分解代谢物基因活化蛋白，这种蛋白可将葡萄糖饥饿信号传递个许多操纵子，使细菌在缺乏葡萄糖时可以利用其他碳源。 二、问答题 （一）、病毒、原核、真核基因组的特点？ 答：1、病毒基因组的特点： ① 种类单一；②单倍体基因组：每个基因组在病毒中只出现一次；③形式多样；④大小不一；⑤基因重叠；⑥动物/细菌病毒与真核/原核基因相似：内含子；⑦具有不规则的结构基因；⑧基因编码区无间隔：通过宿主及病毒本身酶切；⑨无帽状结构；⑩结构基因没有翻译起始序列。

2、原核基因组的特点：

①为一条环状双链DNA；②只有一个复制起点；③具有操纵子结构；④绝大部分为单拷贝；⑤可表达基因约50%，大于真核生物小于病毒；⑥基因一般是连续的，无内含子；⑦重复序列很少。 3、真核基因组的特点：

①真核生物基因组远大于原核生物基因组，结构复杂，基因数庞大，具有多个复制起点；②基因组DNA与蛋白质结合成染色体，储存于细胞核内；③真核基因为单顺反子，而细菌和病毒的结构基因多为多顺反子；④基因组中非编码区多于编码区；⑤真核基因多为不连续的断裂基因，由外显子和内含子镶嵌而成；⑥存在大量的重复序列；⑦功能相关的基因构成各种基因家族；⑧存在可移动的遗传因素；⑨体细胞为双倍体，而精子和卵子为单倍体。 （二）、乳糖操纵子的作用机制？

答：1、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结

构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因I。

2、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种机制为可诱导的负。

3、CAP的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正，加速合成分解乳糖的三种酶。

4、协调调节：乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负与CAP的正两种机制，互相协调、互相制约。 （三）、真核生物转录水平的机制？

答：真核生物在转录水平的主要是通过反式作用因子、顺式作用元件和RNA聚合酶的相互作用来完成的，主要是反式作用因子结合顺式作用元件后影响转录起始复合物的形成过程。

1、 转录起始复合物的形成：真核生物RNA聚合酶识别的是由通用转录因子与DNA形成的蛋白质-DNA复合物，只有当一个或多个转录因子结合到DNA上，形成有功能的启动子，才能被RNA聚合酶所识别并结合。

转录起始复合物的形成过程为：TFⅡD结合TATA盒；RNA聚合酶识别并结合TFⅡD-DNA复合物形成一个闭合的复合物；其他转录因子与RNA聚合酶结合形成一个开放复合物。

在这个过程中，反式作用因子的作用是：促进或抑制TFⅡD与TATA盒结合；促进或抑制RNA聚合酶与TFⅡD-DNA复合物的结合；促进或抑制转录起始复合物的形成。

2、 反式作用因子：一般具有三个功能域（DNA识别结合域、转录活性域和结合其他蛋白结合域）；能识别并结合上游区中的顺式作用元件；对基因的表达有正性或负性作用。 3、 转录起始的：

⑪反式作用因子的活性调节：①表达式调节——反式作用因子合成出来就具有活性；②共价修饰——磷酸化和去磷酸化，糖基化；③配体结合——许多激素受体是反式作用因子；④蛋白质与蛋白质相互作用——蛋白质与蛋白质复合物的解离与形成。

⑫反式作用因子与顺式作用元件的结合：反式作用因子被激活后，即可识别并结合上游启动子元件和增强子中的保守性序列，对基因转录起调节作用。

⑬反式作用因子的作用方式——成环、扭曲、滑动、Oozing。 ⑭反式作用因子的组合式作用：每一种反式作用因子结合顺式作用元件后虽然可以发挥促进或抑制作用，但反式作用因子对基因不是由单一因子完成的而是几种因子组合发挥特定的作用。 （四）、真核生物转录后水平的机制？ 答：（1）、5，端加帽和3，端多聚腺苷酸化的意义：5，端加帽和3，端多聚腺苷酸化是保持mRNA稳定的一个重要因素，它至少保证mRNA在转录过程中不被降解。 （2）、mRNA选择性剪接对基因表达的作用 （3）、mRNA运输的控制 （九）、分子克隆中常用的工具酶及良好载体的条件？ 答：（1）、常用的工具酶 1、 性核酸内切酶：是细菌产生的一类能识别和切割双链DNA分子内特定的碱基顺序的核酸水解酶。

2、 DNA连接酶：将两段DNA分子拼接起来的酶。 3、 DNA聚合酶：催化单核苷酸链延伸。

4、 逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶，这是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，产物DNA又称互补DNA。

5、 末端脱氧核糖核酸转移酶：将脱氧核糖核酸加到DNA的3末端。

6、 碱性磷酸酶：催化去除DNA、RNA等的5磷酸基团。

7、 依赖DNA的RNA聚合酶：识别特异性启动子，RNA转录。 （2）、良好载体的条件

1、必须有自身的复制子；2、载体分子上必须有性核酸内切酶的酶切位点，即多克隆位点，以供外源DNA插入；3、载体应具有可供选择的遗传标志，以区别阳性重组子和阴性重组子；4、载体分子必须有足够的容量；5、可通过特定的方法导入细胞；6、对于表达载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、增强子、加尾信号等DNA元件。 （十）、蓝-白筛选的原理？

答：某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因区外又另外引入了一段含多种单一酶位点的DNA序列。这些位点上如果没有克隆外源性DNA片段，在质粒被导入lac-的大肠杆菌后，质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达，与大肠杆菌的半乳糖苷酶基因互补，产生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物X-gal和诱导剂IPTG后，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lac Z基因灭活，不能生成半乳糖苷酶，结果菌落出现白色。由于这种颜色标志，重组克隆和非重组克隆的区分一目了然。

十一）SANGER双脱氧链终止法的原理？

答：DNA链中核苷酸以3’,5’-磷酸二酯键连接，合成DNA所用的底物是 2’-脱氧核苷三磷酸。2’,3’ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基。在DNA聚合酶作用下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA链中，但由于没有3’羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链不能继续延伸。在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争，产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于引物末端到出现过早链终止位置间的距离。在4组酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的A、C、G或T位置。 （十二）、核酸分子杂交的原理？

答：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及在复性过程中个分子间键的形成和断裂。杂交的双方是待测核酸和已知序列。 （十三）、影响杂交的因素？

答：1、核酸分子的浓度和长度：核酸浓度越大，复性速度越快。探针长度应控制在50-300个碱基对为好。

2、温度：温度过高不利于复性，而温度过低，少数碱基配对形成的局部双链不易解离，适宜的温度是较TM值低25度。

3、离子强度：在低离子强度下，核酸杂交非常缓慢，随着离子强度的增加，杂交反应率增加。高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，

所以进行序列不完全同源的核酸分子杂交时必须维持杂交反应液中的盐浓度和洗膜液中的盐浓度。

4、杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的TM值。它有以下优点：在低温下探针更稳定；能更好地保留非共价结合的核酸。 5、核酸分子的复杂性：是指存在于反应体系中的不同顺序的总长度。两个不同基因组DNA变性后的相对杂交速率取决于样品浓度绝对一致时的相对复杂性（即DNA中的碱基数）。

6、非特异性杂交反应：在杂交前应对非特异性杂交反应位点进行封闭，以减少其对探针的非特异性吸附作用。 （十六）、PCR的基本原理？

答：PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需要重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高温变性、低温退火、中温延伸３个步骤构成PCR反应的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的DNA得以迅速扩增。DNA模板变性：模板双链DNA?单链DNA，94℃。退火：引物＋单链DNA?杂交链，引物的Tm值。引物的延伸：温度至70 ℃左右， Taq DNA聚合酶以４种dNTP为原料，以目的DNA为模板，催化以引物３’末端为起点的5’→3’DNA链延伸反应，形成新生DNA链。新合成的引物延伸链经过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR，就是如此反复循环，使目的DNA得到高效快速扩增。 （十七）、PCR引物设计的基本要求？

答：1、引物长度一般为15～30个核苷酸。过短影响PCR的特异性，过长会提高相应退火温度，使延伸温度超过TaqDNA聚合酶最适温度74℃,影响产物的生成。

2、引物的碱基尽可能随机，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象。3’端不应有连续3个G和C。否则会使引物和模板错误配对。G+C含量一般占45％ -55％。3’端和5’端引物具有相似的Tm值,Tm值计算公式：Tm＝4(G+C)+ 2(A+T)

3、引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。引物的连续互补序列，一般不超过3bp。 4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3’端的互补重叠。 5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不超过70％，引物3’末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。 6、引物3’端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3’端最佳碱基选择是G和C，形成的碱基配对比较稳定。 7、引物与模板结合时，引物的5’端最多可以游离十几个碱基而不影响PCR反应的进行。

8、引物的5’端可以修饰，如附加酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子、终止密码子等 （十八）、PCR的反应条件？ 答：1、PCR反应的缓冲液： ? Tris-HCl缓冲液

? KCl 促进引物的退火，浓度太高时会抑制Taq DNA聚合酶活性。 ? 加入BSA或明胶有利于保护TaqDNA聚合酶活性。

? 必要时加入适量二甲基亚砜(DMSO)或甲酰胺利于破坏模板二级结构，提高PCR反应特异性。

2、镁离子浓度 一般用量1.5-2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶活性需要Mg 2+。Mg 2+浓度过低，会显著降低酶活性。Mg 2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。Mg 2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。

3、底物浓度 工作浓度20-200umol/L， dNTPs浓度过高可加快反应速度，也增加碱基的错配率和实验成本。降低浓度会导致反应速度下降，可提高反应的特异性。在PCR反应中，4种dNTP必须以等摩尔浓度配制，以减少PCR反应的错配误差并提高使用效率。

4、Taq DNA聚合酶 75-80℃时具有最高的聚合酶活性，150个核苷酸/秒；具有良好的热稳定性，95℃仍有活性，应用浓度一般为1-2.5u/100ul反应体积。 5、引物 0.1-0.5umol/L。引物浓度偏高会引起错配或非特异性扩增、生成引物二聚体，使目的DNA片段产率下降。退火温度与引物Tm值有关，引物Tm值在55-80 ℃ 范围较为理想。 6、反应温度和循环次数 （十九）、影响大肠杆菌系统外源基因表达的因素？

答：1、启动子的强弱；2、基因的剂量；3、影响RNA转录和翻译效率的因素：SD序列、mRNA；4、外源基因密码子的选择；5、表达产物的大小；6、表达产物的稳定性。 （二十）、大肠杆菌系统表达外源基因必须具备的条件？ 答：1、要求外源基因的编码区不能含有内含子；

2、表达的外源片段要位于大肠杆菌启动子的下游，并形成正确的阅读框架；

3、转录出的mRNA必须有与大肠杆菌16S rRNA3，末端相匹配的SD序列，才能被有效的翻译成蛋白质。

4、蛋白产物必须稳定，不易被细胞内蛋白酶快速降解，且对宿主无害。

（二十二）、转基因动物的概念、原理及应用？

答：1、概念：是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。它的特点是“分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达”。

2、基本原理：将目的基因或基因组片段用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物的输卵管或子宫中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物，人们可以通过分析转基因和动物表型的关系，揭示外源基因的功能；也可以通过转入外源基因培育优良的动物品种。

3、应用：建立用于研究外源基因表达体系；建立医学中常用的疾病模型；培育动物新品种；药理学和药用蛋白的生产研究。 （二十三）、基因敲除的基本程序？

答：通过DNA同源重组，使得胚胎干细胞特定的内源基因被破坏而造成功能丧失，然后通过胚胎干细胞介导得到该基因丧失的小鼠模型的过程称为基因敲除。

1、 打靶载体的构建：同源序列要足够长，要含有筛选用的标志基因。

2、胚胎干细胞的体外培养 3、打靶载体导入胚胎干细胞 4.同源重组胚胎干细胞的筛选

5、基因敲除胚胎干细胞注射入胚泡

6.胚泡植入假孕小鼠的子宫中

7.杂交育种获得纯合的基因敲除动物 （二十四）、DNA芯片的原理？

答：DNA芯片技术就是一种大规模的集成的固相核酸分子杂交，以大量已知碱基序列的寡核苷酸片段为探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息。其方法包括芯片的制备、样品的准备、分子杂交和检测分子。 （二十七）、基因治疗的策略？

答：1、基因置换或称基因矫正：特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，让导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因，不涉及基因组的任何改变。